Dal punto di vista ecologico, il Parco rappresenta un collegamento fondamentale tra le residue aree di importanza naturalistica della città di Roma – tra cui le ville storiche, il corso del Tevere, aree agricole periferiche e altri siti più o meno compresi nella rete regionale di Aree Protette – e il territorio dell'Agro romano.
Aldilà dell'eccezionale valore monumentale e paesaggistico che ha incantato i viaggiatori del passato, il Parco rappresenta un grande polmone verde per i residenti dei quartieri di Roma sud-est.
Grazie all'estensione e alla discreta varietà ambientale dell'area, nonostante la sua posizione a ridosso della città, il Parco dell'Appia Antica può vantare una biodiversità che annovera qualcosa come più di 500 specie di flora, tra cui 13 diverse varietà di orchidee. Quanto alla fauna sono state individuate 3 specie di pesci, 6 di anfibi, 13 di rettili, 17 di mammiferi e 89 di uccelli. Tra questi ultimi, grazie a una ricerca appena conclusa, si è potuta quantificare la presenza delle specie nidificanti: ben 57, a pochi chilometri dal Colosseo.
In certe sere d'estate, lungo le sponde dei fossi di Tor Carbone e dell'Annunziatella, si vedono ancora le lucciole. Una presenza inattesa che riassume l'importanza del Parco per il mantenimento della biodiversità e la tutela dei paesaggi, ed anche di una superstite naturalità in grado di offrire rifugio a specie inaspettate. Una ricchezza di specie, naturalmente, da valutare rispetto agli ambienti presenti e alla particolare collocazione dell'Area Protetta. Così, tra i mammiferi presenti abbondano naturalmente le specie "generaliste" e cioè quelle con esigenze ecologiche più flessibili: è il caso della volpe, della donnola, di ratti e topo selvatico. Segnalazioni sporadiche riguardano il riccio e la talpa e, più recentemente, anche la lepre, il coniglio selvatico, la crocidura minore.
Più diffusi gli uccelli, con presenze di indubbio interesse quali il nibbio bruno, l'airone cenerino, la beccaccia e il beccaccino, il cannareccione, il tarabuso. Una ricerca assai recente ha permesso il censimento di 57 specie nidificanti (i tre quarti di quelle presenti a Roma), tra cui 16 inserite tra quelle di interesse conservazionistico in Europa, come la quaglia, il gruccione, il torcicollo, l'averla piccola. E nel 2008 altre specie di tutto rispetto si sono aggiunte, quali il tarabusino e il picchio rosso minore. Menzione a parte meritano il parrocchetto dal collare (Psittacula krameri) e il pappagallo monaco, due specie di pappagalli di provenienza esotica segnalate a Roma rispettivamente dagli anni Ottanta e Novanta ed oggi in forte espansione nell'intera area urbana.
Tra gli ambienti del Parco, le piccole zone umide sono l'habitat d'elezione di anfibi quali la rana verde e il rospo smeraldino, il tritone punteggiato e la raganella, quest'ultima segnalata nel Parco degli Acquedotti. Di pesci quali lo spinarello e la rovella esistono segnalazioni di una decina d'anni fa in attesa di conferme, come pure del ghiozzo di ruscello. Presenze di notevole interesse naturalistico, al pari di quella del granchio d'acqua dolce – raro in tutta la provincia di Roma - a Tor Marancia e alla Caffarella.
Sono circa 500 le specie floristiche censite nel Parco, particolarmente abbondanti in quelle aree con un certo grado di qualità ambientale come la valle della Caffarella e l'area archeologica della Villa dei Quintili. Quelle caratteristiche delle zone più calde della costa tirrenica, come il lentisco, il terebinto e la fillirea, crescono solo sulle sommità di alcuni ruderi; altre specie legate a condizioni più fresche ed umide, come l'orchidea acquatica, il ranuncolo peltato e l'ortica a campanelli, rappresentano presenze uniche nell'intera città di Roma. Boschetti a roverella, sughere e lecci sono la testimonianza delle antiche foreste tirreniche ma anche dei "boschi sacri" impiantati dai Romani in particolari punti dell'Appia.
Il territorio del Parco ricade ai piedi dell'edificio vulcanico dei Colli Albani, apparato generatosi a partire da circa 600.000 anni fa, che all'apice dell'attività eruttiva raggiungeva i 2.000 metri di altitudine. La stessa antica sede stradale dell'Appia poggia sulla più imponente delle colate laviche del vulcano dei Colli Albani, quella di Capo di Bove.
Pure dall'area dei Castelli Romani ha origine il sistema di corsi d'acqua che solca il territorio del Parco, tra cui si distinguono per rilievo il fiume Almone e il fosso dell'Acqua Mariana. Diffuse anche sorgenti e zone umide come alla Caffarella, a Tor Carbone e alle Tre Fontane.
La natura del substrato e la presenza dei corsi d'acqua sono la causa prima del paesaggio naturale del Parco – oggi fortemente modificato da quello di origine antropica – caratterizzato da pianori sommitali attraversati da valli più o meno profondamente incise.
