E' un lembo di Lazio che s'incunea tra le terre senesi ed umbre. Un polmone verde di foreste quasi interamente demaniali che ammantano fino ai 734 metri della sommità il monte Rufeno. A percorrerne i sentieri, è possibile sperare in un incontro con il cinghiale, il picchio rosso, il nibbio bruno, addirittura con lo scoiattolo o il Capriolo. Per conoscerne da vicino la ricchissima flora il posto giusto è il Museo del Fiore, allestito all'interno del casale Giardino presso Torre Alfina.
La posizione geografica decentrata, che assicura tranquillità e scarso disturbo antropico, ha consentito nell'area della Riserva la conservazione di una discreta fauna nonostante le quote non elevate e relativa facile accessibilità all'intero territorio. Tra i mammiferi sono presenti ad esempio il Capriolo, il tasso, l'istrice, la martora e, di passaggio, il lupo. Anche tra gli anfibi e i rettili sono segnalate specie di tutto interesse come la salamandrina dagli occhiali, la testuggine palustre, l'ululone dal ventre giallo. Granchi e gambero di fiume testimoniano della relativa integrità ambientale. Quanto all'avifauna, essa comprende circa settanta specie di uccelli nidificanti, tra cui rapaci come falchi pecchiaioli, sparvieri e nibbi bruni, oppure passeriformi quali l'averla piccola e la magnanina. Anche il fiume Paglia conserva una fauna ittica abbondante. Le specie più comuni di pesci che vivono nelle sue acque sono il cavedano, il barbo, la carpa ed il vairone, ma anche il più raro ghiozzo di ruscello. Lo sanno bene gli uccelli ittiofagi (cioè, letteralmente, che si cibano di pesce) ch'è possibile osservare lungo le sponde, come il martin pescatore, la garzetta, l'airone cenerino e il bianco maggiore. Lungo il corso del Paglia, inoltre, è segnalato il raro occhione.
A Monte Rufeno sono state censite ben 1012 specie di piante superiori, tra cui molte rare e vulnerabili che qui hanno le uniche stazioni note a livello regionale. Tra le più vistose ci sono le orchidee, appartenenti a 39 distinte varietà Inoltre gli elenchi redatti dai botanici comprendono specie meno vistose ma di non minore interesse quali il brugo, la Crespolina etrusca e l'erba scopina. Tra le specie più note, al contrario, sono il giglio rosso, il narciso dei poeti.
Nella Riserva si trova anche una delle stazioni più meridionali del brugo, pianta rara nel Lazio, e una delle più settentrionali del farnetto. Moltissime anche le varietà di funghi, tra cui una specie (Tricholoma rufenum) scoperta e studiata per la prima volta all'interno dell'area protetta.
Il territorio della Riserva è caratterizzato da una morfologia dolce che si inserisce nel tipico paesaggio collinare dell'Alto Lazio e della Toscana meridionale. I rilievi, che raggiungono quote modeste (massima 774 m s.l.m.), digradano verso l'ampia valle del fiume Paglia, che nasce dal monte Amiata e confluisce nel Tevere, che divide la Riserva in due settori: quello più grande al cui centro si eleva monte Rufeno e l'altro nella zona di Torre Alfina.
Numerosi affluenti del Paglia, di carattere torrentizio, attraversano la Riserva o ne delimitano i confini tra cui il Subissone (nei pressi di Torre Alfina), il Fossatello, il Tirolle e l'Acquachiara.
